厭氧性細菌的分離培養法 

 厭氧菌需有較低的氧化—還原勢能才能生長(例如破傷風梭狀芽孢桿菌需氧化—還原電勢降低**0.11V時才開始生長)，在有氧的環境下，培養基的氧化—還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長。為使培養基降低勢，降低培養環境的氧壓是十分必要的。現有的厭氧培養法甚多，主要有生物學，化學和物理學3種方法，可根據各實驗室的具體情況而選用。  1．生物學方法 

    培養基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發芽谷物等)或動物組織(新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等)，由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養基的應用，就是根據這個原理)，組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢下降。 

     另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養在一個平皿內，利用需氧菌的生長將氧消耗后，使厭氧菌能生長。其方法是將培養皿的一半接種吸收氧氣能力強的需氧菌(如枯草桿菌)，另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37恒溫箱中培養2~3d后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。  2．化學方法 

    利用還原作用強的化學物質，將環境或培養基內的氧氣吸收，或用還原氧化型物質，降低氧化—還原電勢。 

 （１）李伏夫(B．M．JIbbob)法 

    此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣，其反應式如下： 

    Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02 

    取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(如系液體培養基，則直立于罐內)，**上端保留可容納1~2個平皿的空間(視玻罐的體積而定)，按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內水分過多。若用無蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉(如圖１－５)。  （２）焦性沒食子酸法 

 焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時由淡棕變為深棕色的焦性沒食橙(Purpurgallin)。每l00cm3空間用焦性沒食子酸1g及10％氫氧化納或氫氧化鉀l0ml，其具體方法主要有下列幾種：  1）單個培養皿法： 

 將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在其上放焦性沒食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養皿倒置于其上，周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養皿放人37C溫箱培養24~48h后，取出觀察。 

 2）Buchner氏試管法： 

 取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養管放人大試管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍封以石蠟，37培養24~48h后觀察(圖１－６)。  ３） 玻罐或干燥器法： 

 置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養皿或試管置于隔板上，并在玻罐內置美藍指示劑一管，從罐側加入氫氧化鈉溶液放于罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準備好后．將線放下，使焦性沒食子酸落人氫氧化納溶液中，立即將蓋蓋好；封緊，置溫箱中培養。  ４）瑞(Wright)氏法： 

 將已接種細菌的培養管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后，塞人管中離培養基1~1．5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養(圖１－７)。  ５）史(Spray)氏法： 

 用圖１－８所示的厭氧培養皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置氫氧化鈉溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封完全，然后搖動底部，使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養。  ６）平皿法： 

 置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養（圖１－９）。  ７）硫乙醇酸鈉法  

硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原性物質，促使厭氧菌生長。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。  A．液體培養基法： 

 將細菌種人含0.1％的硫乙醇酸鈉液體培養基中，37℃培養24~48h后觀察，本培養基中加美藍液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍被還原成無色。  Ｂ．固體培養基法： 

 常采用特殊構造的Brewer培養皿，可使厭氧菌在培養基表面生長而形成孤立的菌落；操作過程是先將Brewer氏皿干熱滅菌，將溶化且冷卻**50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養基傾人皿內。待瓊脂冷   凝后，將厭氧菌接種于培養基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內緣與培養基外圍部分相互緊密接觸（圖１－10)。此時皿蓋與培養基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍應逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故仍呈藍色。將Brewer氏培養皿置于37℃恒溫箱內，經過24~48h后觀察。  3．物理學方法   #p#分頁標題#e#

 利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅除或隔jue環境及培養基中的氧氣，使其形成厭氧狀態，有利于厭氧菌的生長發育。    （１）厭氧罐法 

    常用的厭氧罐有Brewer氏罐，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐（圖１－11）。將接種好的厭氧菌培養皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣**大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個厭氧罐放人孵育箱培養。本法適用大量的厭氧菌培養。  （２）真空干燥器法   

 將欲培養的平皿或試管放人真空干燥器中，開動抽氣機，抽**高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳氣體。將整個干燥器放進孵育箱培養。  （３）高層瓊脂法   

   加熱融化高層瓊脂，冷**45℃左右接種厭氧菌，迅速混合均勻。冷凝后37℃培養，厭氧菌在近管底處生長。  （４）加熱密封法   

   將液體培養基放在阿諾氏蒸鍋內加熱l0min，驅除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養基液面覆蓋一層約0.5cm的無菌凡士林石蠟，置37℃培養。此外，尚有搖振培養法，此處從略。  （５）二氧化碳培養法 
少數細菌如布氏桿菌(牛型)等，孵育時，需大氣中添加5％~10％二氧化碳，方能使之生長繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養箱中進行培養；**簡單的二氧化碳培養法是在盛放培養物的有蓋玻璃缸內，燃點蠟燭，當火焰熄滅時，該缸的大氣中，就約增加了5％~10％的二氧化碳。也可用化學物質作用后生成二氧化碳，如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4％NaHCO3與30％H2SO4lmL，則可產生22.4mL的二氧化碳氣體。