對簡單,可用于那些對厭氧要求相對較低的一般厭氧菌的培養(yǎng),如堿性焦性沒食子酸法、厭氧罐培養(yǎng)法、庖肉培養(yǎng)基法等。本實驗將主要介紹這三種,它們都屬于**基本也是**常用的厭氧微生物培養(yǎng)技術(shù)。其中有些厭氧微生物要求高的培養(yǎng)研究,對實驗儀器也有較高的要求,如主要用于嚴(yán)格厭氧菌分離和培養(yǎng)的亨蓋特技術(shù)、
厭氧培養(yǎng)箱(手套箱)法等。
厭氧培養(yǎng)箱已逐漸普及,本實驗也作簡要介紹。
1.堿性焦性沒食子酸法
焦性沒食子酸與堿溶液(NaOH、Na2CO3或NaHCO3)作用后形成易被氧化的堿性沒食子鹽,能通過氧化作用而形成黑、褐色的焦性沒食子橙從而除掉密封容器中的氧。這種方法的優(yōu)點是無需特殊及昂貴的設(shè)備,操作簡單,適用于任何可密封的容器,可迅速建立厭氧環(huán)境,適用于前期實驗性探索研究;而其缺點是在氧化過程中會產(chǎn)生少量的一氧化碳,對某些厭氧菌的生長有抑制作用,同時,NaOH的存在會吸收掉密閉容器中的二氧化碳,對某些厭氧菌的生長不利。用NaHCO3。代替NaOH,可部分克服二氧化碳被吸收問題,但卻又會導(dǎo)致吸氧速率的降低。當(dāng)然,大批量厭氧培養(yǎng)需消耗大量實驗藥品,并產(chǎn)生大量廢液,可能引起環(huán)境污染。
2.厭氧罐培養(yǎng)法
利用一定方法在密閉的厭氧罐中生成一定量的氫氣,而經(jīng)過處理的鈀或鉑可作為催化劑催化氫與氧化合形成水,從而除掉罐中的氧而造成厭氧環(huán)境。由于適量的CO2(2%~10%)對大多數(shù)的厭氧菌的生長有促進作用,在進行厭氧菌的分離時可提高檢Ⅲ率,所以一般在供氫的同時還向罐內(nèi)供給一定的CO2。厭氧罐中H2及CO2的生成可采用鋼瓶灌注的外源法,但更方便的是利用各種化學(xué)反應(yīng)在罐中自行生成的內(nèi)源法,例如,鎂與氯化鋅遇水后發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生氫氣,碳酸氫鈉加檸檬酸水后產(chǎn)生CO2:
Mg+ZnCl2+2H2O→MgCl2+Zn(OH)2+H2↑ C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑
厭氧罐中使用的厭氧度指示劑一般都是根據(jù)亞甲藍(methylene blue)在氧化態(tài)時呈藍色而在還原態(tài)時呈無色的原理設(shè)計的。目前,厭氧罐技術(shù)早已商業(yè)化,有多種品牌的厭氧罐產(chǎn)品(厭氧罐罐體,催化劑、氣體發(fā)生袋、厭氧指示劑)可供選擇。它實際上已經(jīng)同
厭氧培養(yǎng)箱類似,但因為體積小、攜帶方便,使用起來十分方便。圖3—13顯示了一般常用的厭氧罐的基本結(jié)構(gòu)。
3.庖肉培養(yǎng)基法
堿性焦性沒食子酸法和厭氧罐培養(yǎng)法都主要用于厭氧菌的斜面及平板等固體培養(yǎng),而庖肉培養(yǎng)基法則在對厭氧菌進行液體培養(yǎng)時**常采用。該方法基本原理是,將精瘦牛肉或豬肉經(jīng)剁切、煮干、密閉保存處理后配成庖肉培養(yǎng)基,其中既含有易被氧化的不飽和脂肪酸能吸收氧,又含有谷胱甘肽(GSH)等還原性物質(zhì)可形成負氧化還原電勢差,再加上將培養(yǎng)基煮沸驅(qū)氧及用石蠟凡士林封閉液面,可用于培養(yǎng)厭氧菌。這種方法是保藏厭氧菌,特別是厭氧的芽孢菌的一種簡單可行的方法。若操作適宜,比如額外添加100μg/ml。的新霉素,嚴(yán)格厭氧菌都可獲得生長。
4.厭氧培養(yǎng)箱(手套箱)法
同以上三種方法相比,厭氧培養(yǎng)箱(圖3一14)的厭氧環(huán)境**高,非常適用于培養(yǎng)**厭氧微生物。該方法的優(yōu)點是提供一個大的厭氧培養(yǎng)空間,保證高度無氧環(huán)境,由于系統(tǒng)的高度集成,無需上述方法的復(fù)雜操作過程,無大量化學(xué)廢物產(chǎn)生。該方法的工作原理是注入氫氣H2透過鈀[鈀催化劑片或鈀桶(帶熱量)]催化氫氧化合作用把腔內(nèi)的氧氣化成水,除去氧O2
因此氧濃度很低。產(chǎn)生的水蒸氣通過系統(tǒng)的干燥管進行干燥。從而達到手套箱內(nèi)干燥的效果,也同時減少系統(tǒng)操作臺內(nèi)的氧氣的含量。上述化學(xué)反應(yīng)中的熱量和催化劑鈀是系統(tǒng)構(gòu)造中的加熱器來完成的,如圖3一14所示。
氣閥的作用是在使用前,充進惰性氣體的人口,常充進的惰性氣體有氮氣(85%)、氫氣(10%)和二氧化碳(5%),通過真空泵的往復(fù)抽吸置換,達到了痕量氧的環(huán)境。
注意:混合氣體的成分根據(jù)需要而定。其中二氧化碳的主要功能是提供厭氧培養(yǎng)需要的氣源,氫氣用于除氧,氨氣用于保持厭氧培養(yǎng)箱的無氧氛圍。